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饲料中呋喃唑酮测定方法

发布时间:2008-06-26  来源:中国牧业网
摘要:呋喃唑酮(furazolidone)又名痢特灵,是一种抗菌类物质,具有抑菌性和杀菌性,可用于防治球虫

    呋喃唑酮(furazolidone)又名痢特灵,是一种抗菌类物质,具有抑菌性和杀菌性,可用于防治球虫病、细菌性痢疾等畜禽疾病,还可用作治疗和预防猪、牛及家禽病的抗微生物类药物。然而,因其在动物体内的残留,食用鱼类禁用,其他动物的使用剂量也必须严格控制,因此对呋喃唑酮及其残留产物进行定量检测十分必要。目前,世界上许多国家和地区对部分人药、兽药的使用及添加剂量都颁布了相应的法令和法规加以限制。例如美国的食品和药品管理局(FDA)规定的禁用和限用的食用动物用药包括:氯霉素、克伦特罗、己烯雌酚、硝基咪唑类物质、呋喃唑酮、硝基呋喃和一些磺胺类药物(泌乳奶牛用)等。我国于1999年制定出《饲料和饲料添加剂管理条例实施细则》,对食用动物用药及其剂量都有明确规定。

    1呋喃唑酮的测定方法

    呋喃唑酮呈黄色粉末状,味苦,微溶于氯仿,不溶于水和乙醇,其分子量为225.16,熔点245-258℃。它是由乙醇胺经缩合反应,亚硝化、环合、还原后再经缩合而制得的。以往理论认为:呋喃唑酮是一种光敏性物质,见光易分解。目前,在分析化学领域采用紫外分光光度法能测出其最终光分解总量,结合高效液相色谱法对其光分解溶液的4种分解产物进行分析,发现仅有很小部分发生了分解;而运用质谱仪和远红外光谱仪也可证实呋喃唑酮一般较稳定,不易分解。下面对呋喃唑酮的分析测定,就质量检测法、分光光度法和高效液相色谱法分别作一介绍。

    1.1质量检测法此法是将饲料碾碎过筛后,分别用二甲基甲酸胺(DMF)试剂和乙二胺试剂进行测试。

    1.1.1DMF测试放9滴DMF和1滴氢氧化钾醇溶液于白色凹盘中的3个低凹处,再将0.01g 饲料试样喷洒到每个低凹处液滴上,用显微镜观察,当呋喃唑酮含量大于25mg/kg时,会生成易于观测的亮蓝色物质。

    1.1. 2乙二胺测试

    把干滤纸放在培养皿底部,并将试样均匀地喷洒在滤纸上,再将一定量的乙二胺分布于滤纸边缘,用显微镜在10X档观测,若有深红色物质生成则为呋喃唑酮。然而,在动物饲料中常混有血粉,也会与乙二胺试剂反应呈深红色而干扰试验,加上此法为半定量法,故存在一定的局限性。

    1.2分光光度法

    本法的机理是在DMF介质溶液中,呋喃唑酮与苯肼盐酸溶液反应生成在440nm处有强吸收的亮黄色物质。因其最佳工作曲线测定范围是0-50mg/kg,故称取相应质量的碾碎过筛的饲料样品于锥形瓶中,准确加入DMF,加盖,在水浴锅中煮沸5min,再置于调速振摇皿上振摇10min后,于快速滤纸上过滤。取一定体积的滤液酌量稀释到容量瓶中即制得试样。取同等体积的试样和用DMF配制的各标准工作溶液于比色管中,向每支管中加入5mL苯肼盐酸溶液,混匀后置于70℃水浴中25min,再于15℃水浴中冷却5min,然后准确加入甲苯到各比色管中,加盖,振摇一定时间后将甲苯层用脱脂棉滤入比色皿中,使用分光光度计于440nm处读取吸光值,进行测定。此法简单易行,准确度较高,对于设施不太完善的实验室有较好的应用价值。

    1.3高效液相色谱法(HPLC)现在据资料可查的较常用的3种HPLC法其色谱条件基本一致:采用光脉冲式泵,流速控制在0.l-2.0mL/min;若为进样环则体积为20-50mL;紫外可见检测器(UV)波长为365nm;保护柱:反相柱C18或C8(柱填料粘度≤10μm)柱均可。这3种方法的差异主要在于试样的前处理,以及由此而选用的流动相和标准溶液的配制。

    1.3.1乙腈-水溶出法

    此法是利用乙腈和水将一定质量的粉碎过筛的饲料样品溶出,离心后准确量取一定体积的上清液置于分液漏斗中,用正己烷提取二次后弃去,水层则用氯仿提取二次合并提取液,用铺有脱脂棉与无水硫酸钠的干燥滤器过滤,而滤器又用氯仿3次洗涤,合并滤液与洗液于250mL蒸馏瓶中,40℃下减压旋转蒸发至于后,向残渣中准确加入乙腈,使呋喃唑酮充分溶解,最后离心10min,清液上HPLC检测。因试样是用乙腈提取,故呋喃唑酮的标准溶液和标准工作溶液也用乙腈溶解、定容,上HPLC后制作标准曲线。流动相则采用乙腈一0.05 M磷酸二氢钾-三乙醇胺(30∶70∶1),pH=6.0,流速为1.0mL/min。由于呋喃唑酮微溶于氯仿,不溶于水,按照萃取过程的两相分配理论,用氯仿进行萃取和洗涤提取不够完全,加之此法操作步骤较多,造成不同程度的损失,故测定结果偏低。

    1.3.2用乙腈一2%乙酸(蒸馏过的)+去离子水(20+80)作流动相流速控制为1.5mL/min,用DMF将0.110±0.05g呋喃唑酮样品稀释定容成110μg/mL的中间标准液,再用等体积的5%四乙基铵溴漠化物(TEAB)将中间液制成55μg/mL的标准工作液(需每日现配)。此法对配合饲料和预混料的前处理方法有异。检测配合饲料,根据标准工作液的量称取碾细混匀的样品到蒸馏套管中,加入一定量的丙酮一水(93+7)的提取液,蒸馏提取8h以上(在蒸馏过程中若发现烧杯中有水,就应加入一定量的丙酮以除去所有的水)。蒸发完后,立即从气浴上移开,加入DMF,再在气浴上加热使所有残余物溶解在DMF中。加入5%TEAB,混合,将溶液注入离心管,冷却后再于2000r/min转速离心数分钟,取上清液,即为制得试液。检测预混料,直接称取样品于锥形瓶中,准确加入DMF,加盖振摇30min,过滤提取物,用DMF稀释到约含呋喃唑酮110μg/mL。取等量5%ThAB和稀释提取物,混匀,冷却至室温后于2000r/min转速离心数分钟,取上清液,即为制得试液。此法尽管准确度较高,但操作较复杂,而且所用的流动相有较强的酸性,对色谱柱有一定的要求。

    1.3.3用乙腈-甲醇(1+1)作为提取剂制备呋喃唑酮贮备液和工作液

    将乙腈一甲醇(1+1)准确加入装有一定质量样品的锥形瓶中,加盖,于回旋振荡器上振摇30min,过中性氧化铝(活度为1)层析柱,弃去前数mL流出液,取随后流出的流出液过滤膜系统,待上HPLC检测,若有必要用提取剂稀释。此法所用流动相为乙酸钠缓冲液(pH6.0)一乙腈(4+1),流速为 0.6mL/min。由于柱层析是靠重力或静压加速流动相流经色谱柱,分离的组分流程周期长,操作难以连续进行。故在实际应用中,我们在振摇静置后,取提取液高速离心取上清液过有机相滤膜系统后,待上HPLC检测。可结合具体仪器配置,选用流动相的比例调整为乙酸钠缓冲液(pH6.0)一乙腈(70%+30%),流速选用0.8mL/min,测定结果较理想。

    2呋喃唑酮测定过程中注意事项

    2.l检测条件

    因呋喃唑酮对光敏感,所有操作都应尽量避光;配制溶液应在通风橱内进行;试验中所用贮备液贮于棕色瓶中,并于0-8℃冰箱中保存,有效期为1个月。工作液则每批样品用时现配。

    2.2检测人员在试验中,操作人员应避免试液接触皮肤和眼睛,避免吸入粉末。一旦进入眼睛应立即用水冲洗15min以上;一旦接触皮肤,应立即用肥皂或柔和的洗涤剂洗去。

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