新城疫基因工程疫苗研究(2)

痘病毒是最大的DAN病毒，基因组长约180～300Kb，用其作为病毒活载体可容纳较多的外源基因，并有大量的复制非必需片段可作为插入外源基因的位点。痘病毒基因组DNA不具有感染性，它在细胞中的复制是在病毒自身的酶和独特的调控信号作用下进行的，与真核细胞的基因表达调控机理不同。有别于其它DNA病毒，痘病毒的转录、翻译和装配均发生在细胞质中，这有利于将外源基因导入痘病毒基因组中及表达产物的检测。重组痘病毒表达的蛋白质存在加工、修饰及转移过程，如糖基化和磷酸化等，以较高级的形式存在，因此抗原性变异不大。由于重组痘病毒活载体苗的这些独特优点，使其最有可能成为实用化的ND基因工程疫苗，因此是国内外众多实验室研究的方向。构建重组痘病毒分两步进行。第一步是构建转移载体质粒，此质粒带有痘苗病毒启动子，其下游连接外源基因，在它们的两侧为痘病毒复制非必需DNA序列。第二步是将转移载体质粒导入痘病毒感染的细胞中，痘病毒DNA与质粒中的同源序列在细胞内发生同源重组，由此将外源基因组装到痘病毒基因组的特定部位，而构建出重组痘病毒。重组痘病毒筛选方法有两种。第一种是以病毒本身的胸苷激酶（TK）基因作为选择标记，采用痘病毒TK基因构建转移载体质粒，在受痘病毒感染的表型为TK－的细胞内发生同源重组，而形成TK－并带外源基因的重组痘苗病毒；在培养液中加入5－溴尿嘧啶脱氧核苷（BudR），TK 病毒不能存活，而TK一重组病毒能增殖。这一系统需要适合病毒生长并能产生蚀斑的TK一细胞系。另一种选择系统是以细菌β半乳糖苷酶（LacZ）基因、新霉素磷酸转移酶（Neo）基因、大肠杆菌Ecogpt基因等作为选择标志，在构建转移载体质粒时，将标志基因和源基因并表达。LacZ与其底物X－gal呈蓝色反应，在含X－gal的培养条件可筛选到蓝色的重组病毒；Neo可使宿主细胞对抗生素G418产生抗性，在含G418的培养条件下可筛选到重组病毒；Ecogpt基因的编码产物为黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，感染重组病毒的细胞能在霉酚酸、氨基嘌呤等嘌呤代谢抑制剂存在的条件下生长。十多年来，已有许多表达NDV基因的重组痘病毒被构建。
虽然对痘苗病毒载体的研究起步最早，但由于痘苗病毒能在哺乳动物体内复制，人们对它的生物安全性存在某种疑问，担心与天花病毒类似的痘苗病毒在动物上应用会进化出对人类有致病性的新病毒，因而重组痘苗病毒难以成为商品化禽用疫苗。基于以上考虑，在哺乳动物中不能复制的鸡痘病毒、鸽痘病毒等具有宿主限制性的食痘病毒无疑是研制ND基因工程疫苗的理想载体。关于重组禽痘病毒的免疫效力，几乎所有的报道都得出相似的结果。即不论是单独表达F或HN糖蛋白之一，还是共表达F和HN糖蛋白，都能使SPF免疫鸡产生对强毒攻击的保护作用，这种免疫力至少维持8周。Taylor等发现，表达F的重组鸡痘病毒的保护率因接种途径而异，口服或滴鼻免疫只能产生部分保护，而肌肉或翅部接种能产生完全保护。口服或滴鼻产生抗体的过程慢而且水平低，而肌肉或翅部接种产生的应答要强烈得多。Letellier等构建的表达F的重组鸽痘病毒也有类似现象。这种差异可能是由于重组病毒在呼吸道不能充分复制所致。Edbauer等构建的表达HN的重组鸡痘病毒一次或二次免疫雏鸡（肌肉接种104TCID50／鸡）均可提供100％保护，而点眼二次和一次免疫仅能提供30％和10％的保护率。
重组禽痘病毒的免疫机理还不明确。SPF鸡接种重组病毒后显然都能产生相应抗体，然而有些重组病毒产生的抗体在体外试验时却不能中和NDV感染。对流感病毒研究表明，产生细胞免疫的抗原主要存在于病毒内部结构蛋白上，但表达流感病毒核衣壳蛋白的重组痘苗病毒却不能产生免疫保护作用，而表达血凝素（HA）的重组痘菌病毒能提供对强毒攻击的抵抗力，这说明体液免疫在清除副粘和正粘病毒感染中起重要作用。用化学方法去除法氏囊的鸡，接种重组鸡痘病毒疫苗后不能抵抗NDV强毒攻击，免疫保护似乎是抗体提供的。Taylor等发现，l日龄商品鸡接种表达F／HN的重组鸡痘病毒疫苗后，28日龄时检测不到针对NDV的HI抗体，但试验鸡却能抵抗强毒感染；显然这种保护作用是接种重组疫苗后产生了足够的记忆性B细胞或细胞免疫引起，或者是两者兼起作用。在Tavlor等的研究中还发现，非肠道途径接种重组鸡痘病毒亦能产生对NDV呼吸道攻毒的保护作用，这和翅翼接种表达禽流感HA的重组禽痘病毒能抵抗呼吸道攻毒的结果相一致。由于种鸡和商品鸡一般都进行针对NDV和FPV的免疫接种，和其它活疫苗一样，重组鸡痘病毒疫苗的应用也有可能受到鸡体内已有的两种免疫的干扰。为了评价针对NDV和FPV的母源抗体对雏鸡接种重组FPV的影响，Taylor等进行了一系列试验。结果发现针对EPV的免疫几乎不影响重组FPV的效果。不管种鸡是否接种过FPV，雏鸡用重组FPV免疫后所产生的对FPV强毒攻击的保护率均为100％。由于针对FPV的免疫主要是细胞免疫，只有非常低水平的FPV抗体经卵黄垂直传递。即使种鸡感染过FPV，在雏鸡也很难检测到FPV抗体，重组FPV在雏鸡体内能够正常复制。用来源于NDV高免种鸡群的1日龄雏鸡（HI几何平均滴度为171）进行试验，接种表达F／HN的重组FPV疫苗的试验组和未接种疫苗的对照组在NDV HI抗体消长规律上基本一致，至28日龄时试验组和对照组的NDV抗体水平都几乎检测不出，但试验组能抵抗强毒攻击。总之，针对FPV和NDV的母源抗体不会明显损害重组FPV引起的免疫。