新城疫基因工程疫苗研究

鸡新城疫（ND）是一种烈性病毒性家禽传染病，被国际兽疫局（OIE）列为对畜禽危害最大的A类传染病之一。本病自1926年被发现以来，已经在世界范围内多次流行，给养禽业造成了巨大的经济损失。免疫接种仍是目前控制ND的主要手段。由于常规疫苗的免疫保护期往往不长，虽然商品鸡群在整个饲养长期内多次进行免疫接种，仍有可能感染新城疫病毒（NDV）强毒，造成非典型ND的流行。因疫苗的广泛使用，从现场鸡群中分离到NDV或检测到NDV抗体，均不能作出ND感染的诊断，这就给ND的诊断和清群带了困难。常规弱毒疫苗和中等毒力疫苗还可在鸡呼吸道复制，引起温和的病变，增加了对细菌继发感染的易感性。为了弥补常规疫苗的不足，国内外许多实验室从80年代末开始利用重组DNA技术研制ND基因工程疫苗，在DNA疫苗、亚单位苗和活载体疫苗方面都进行了探索，NDV主要免疫保护性抗原F和HN已在多种系统中得到表达。1990年表达F基因的重组鸡痘病毒在美国注册。1995年美国农业部正式批准重组鸡痘病毒活载体苗Vector VAX FP－N的商品化，该重组活疫苗免疫效果与常规ND疫苗相当，并且一次免疫即可保护鸡抵抗NDV强毒的攻击。
在DNA疫苗研究方面，日本学者Sakaguchi等将NDV F基因插入质粒载体，F基因的表达受巨细胞病毒早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子控制。一周龄试验鸡肌肉内注射重组质粒后，有2／5注射线性质粒的鸡和4／5注射线性质粒与脂质体转染剂混合物的鸡产生了高水平针对F蛋白的抗体，而注射闭环状质粒的鸡不能产生抗体。免疫9个星期后，体内有抗体的试验鸡都能抵抗致死剂量NDV强毒的攻击。
杆状病毒载体系统是研制ND亚单位苗的主要工具，它是以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒和草地贪夜蛾细胞系统是常用的杆状病毒载体系统研究模型。与细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比，杆状病毒表达系统具有表达产量高。产物可进行翻译后加工特点。该系统表达产物的抗原性、免疫原性等生物活性与天然蛋白相似，并可通过感染昆虫幼虫从而大量提取基因工程产品。迄今为止，已有NDV B1 Hitchner株、Miyadera株、D26株的HN和F基因在杆状病毒系统中表达。经检测表达的F和HN均经过糖基化加工，HN具有神经氨酸酶和血凝素两种活性。用感染重组杆状病毒的家蚕或组织细胞加工制备成油佐剂疫苗，能使免疫接种的试验鸡产生对强毒攻击的抵抗力。MoriH等构建了表达F基因的重组杆状病毒HyF121，用该重组病毒免疫的鸡除能抵抗强毒攻击外，还不诱导产生针对HN和NP的抗体，表明NDV强毒在免疫鸡的体内不能够复制。这样就能方便地用血清学试验来区分重组杯状病毒免疫鸡和自然感染或接种NDV的鸡。
虽然DNA疫苗和亚单位疫苗均显示了良好的免疫性能，而且不会对公众健康和生态环境产生任何潜在的不良影响，但是受禽用疫苗价格的限制，往往难以实际推广和应用。因此，大多数学者主张ND基因工程疫苗研究采用以病毒或细菌为载体的活疫苗技术路线，这方面的研究开始于用痘苗病毒构建重组病毒，随后发展了包括其它种类痘病毒、疱疹病毒、反转录病毒和沙门氏菌减毒株等活载体重组体，其中又以重组痘病毒和重组疱疹病毒研究最为深入，尤其是前者更经常见于报道。经过试验，这些重组体作为疫苗是有效的，兼有活疫苗和亚单位苗的特点，所表达的抗原以半复制的形式提呈给宿主，可成功地诱导各种类型的免疫应答。 疱疹病毒活载体苗的构建方法可参见下文重组痘病毒部分，由于疱疹病毒的复制利用细胞酶系统，所以采用真核启动子构建重组病毒。1991年Morsan R．W．等将NDV的HN、F基因分别克隆火鸡疱疹病毒（HVT）的复制非必需区US2，利用Rous肉瘤病毒LTR的强启动子构建了重组HVT。重组HVT在组织培养和鸡体内都十分稳定，保持了充分的感染性。分别用表达F、HN的重组HVT腹腔接种一日龄SPF白莱航鸡，第28天以NDVTexas GB肌肉接种攻毒，产生了90％和47％的保护率；而经口攻毒时，均不能抵抗NDV在气管内的复制。含有NDV和HVT母源抗体的1日龄商品肉鸡接种表达F的重组HVT，对NDV强毒攻击能产生与B1 Hitchner活疫苗相当的保护率，达73％。重组HVT和野生型HVT免疫鸡对马立克氏病毒强毒攻击提供同等水平的保护。Sakaguchi等构建了表达NDV F蛋白的重组Ⅰ型马立克氏病毒（rMDV1），F基因被插入到Ⅰ型马立克氏病毒US10基因内，在SV40晚期启动子控制下得到显著表达。1日龄SPF鸡接种rMDV1后，4周龄时几乎所有鸡（＞95％）都能抵抗NDV病毒，而对MDV强毒攻击的保护率为100％；针对NDV F和MDV的抗体至少存在11周，国内陈傅言和赵军等亦在HVT中表达了NDV Miydera株的HN基因。