禽流感病毒的分离与鉴定技术(3)

5 禽流感病毒致病力的判定

新分离的禽流感病毒还要进行毒力测定，可采用易感动物试验和血凝素裂解位点氨基酸序列测定来判定其毒力。根据OIE标准，以0.2 mL（1∶10稀释）的无菌病毒感染尿囊液，接种8只4周龄～8周龄SPF易感鸡，隔离饲养，10 d内导致6只或6只以上鸡只死亡的病毒为高致病性的禽流感病毒。即使没有达到上述75%死亡率标准，但是确定是H5或H7亚型，其血凝素的裂解位点存在一系列连续的碱性氨基酸，也视为高致病力禽流感。

静脉接种致病指数（intravenous pathogenicity index, IVPI）也可用于判定毒力，采取以下的判定标准：由A型流感病毒引起的家禽的感染，其致病指数判定为：接种6周龄的SPF鸡，其IVPI大于1.2的，或血凝素的裂解位点处有一系列连续的碱性氨基酸存在的H5、H7亚型流感病毒，判定为高致病力病毒[2]。

6 禽流感病毒的分子检测和鉴定

常规的病毒分离和检测技术是禽流感诊断的常用方法，但是这种方法需要时间较长，不能对高致病性禽流感做出迅速判断。反转录酶链式反应（RT-PCR）方法是一种快速诊断技术，可用于核酸的检测和亚型的鉴定。根据RT-PCR的原理和方法的不同，又分为常规PCR、套式PCR、多元PCR、荧光PCR等。目前常规PCR已成为鉴定禽流感病毒基因的一种重要技术，我国已制定了禽流感病毒通用荧光PCR，H5、H7及H9亚型禽流感病毒荧光PCR检测方法的国家标准。

6.1 RT-PCR

RT-PCR方法是一种敏感特异的方法，即使在病毒基因组水平很低的时候，也可直接检出病毒的基因，灵敏度要高于ELISA，但应注意操作环境污染，造成结果假阳性。

RT-PCR方法的引物选择很重要，一般根据HA或NP基因设计A型流感病毒特异的引物，可根据是否扩增出PCR产物来进行病毒亚型的分型诊断。该方法目前应用较普遍，但应注意使用该方法检测气管样本的敏感性和特异性与病毒分离鉴定的相关性较好，而检测泄殖腔样本则敏感性较低[7]。

6.2 套式RT-PCR

该方法是设计两对引物，一对引物扩增稍长片断，在这一扩增片断内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模板。有人认为该方法与病毒分离鉴定的敏感性相同，也有人认为它过于灵敏，易造成假阳性[8-9]。

6.3 多元RT-PCR

一步法多元RT-PCR是指在一个PCR反应体系中同时设立两对或两对以上引物，用于扩增不同的目的片断。这种方法可以同时检测流感病毒的型和亚型。具有快速、敏感性高的特点[10-11]。

6.4 荧光RT-PCR

为了适应进出口活禽、禽肉制品中禽流感病毒快速检测的需要，建立了禽流感病毒荧光RT-PCR检测系统。禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒系列包括AIV通用型及H5、H7、H9亚型检测试剂盒。检验样本先用AIV通用型试剂盒检测是否含有禽流感病毒，对其中的初检阳性样本再用H5，H7，H9亚型试剂盒分型检测，也可直接进行H5，H7，H9的检测。

荧光PCR是20世纪90年代发展起来的一个新技术，它在PCR过程中利用荧光基因在光激发下释放的荧光量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析，以达到对原始核酸模板定量的目的。目前荧光PCR技术主要有Taq man探针技术和杂交双探针技术。与传统禽流感病毒鸡胚分离方法相比，荧光RT-PCR方法的优势非常明显，主要表现为快速、灵敏、特异、准确，另外该方法安全、应用范围广、取样及样本处理方便、不受疫苗免疫影响。

近年，Spackman E等研究出一种一步法Real-time RT-PCR荧光杂交探针，可以检测禽流感病毒并同时进行H5和H7亚型的鉴定。该方法与病毒分离方法具有很好的一致性，并且具有省时、费用低的特点[12]。

总之，对禽流感的诊断，实验室病毒的分离、鉴定以及致病性试验都耗时较长，费用也较高，分子生物学检测快速、敏感性高，这些诊断检测只有极少数的实验室能够进行。禽流感这类疫病的确诊越快、越早，损失就越小。当怀疑有禽流感发生时，应及时上报疫情，及时送到国家指定的实验室进行诊断是十分重要的。