禽流感病毒的分离与鉴定技术

孙建宏,刘景利,张从禄

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150001）



摘 要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。

关键词:流感病毒;分离;鉴定

禽流感（Avian influenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。

禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。

1 禽流感病毒的分离

样本可采集死禽样本或活禽样本。死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。

采集的拭子放入1.0 mL PBS（pH 7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30 min。对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100 g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3 000 r/min离心10 min，取上清液接种。

采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；如果需长期保存，需放置-70 ℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样本密封后，放在加冰块的保温桶内，尽快送往实验室。

取9日龄～11日龄发育良好的SPF鸡胚，每个样本接种3枚～5枚，每枚尿囊腔内接种0.1 mL，35 ℃～37 ℃条件下孵化3 d～7 d。收获前，鸡胚放在4 ℃条件下冷却4 h或过夜。收获24 h后死亡的鸡胚和活胚的尿囊液，3 000 r/min离心5 min去除血细胞，进行血凝试验。

2 禽流感病毒的初步鉴定

流感病毒颗粒表面的HA蛋白，具有识别并吸附于哺乳动物或禽类红细胞表面受体的结构，因此可以通过血凝试验进行检测。

HA试验是通过倍比稀释收获的鸡胚尿囊液，加入等体积的一定稀释度的鸡红细胞，观察血凝情况。如果收取的尿囊液没有血凝价，继续盲传2代；如果有血凝活性，应通过血凝抑制试验确定分离的病毒。

证明尿囊液样本具有血凝活性后，还要进一步确定是哪些抗原在起作用。通常禽流感、禽副粘病毒（如ND）、禽腺病毒等都具有血凝活性，通过HI试验来鉴定，如果抗NDV等的血清能够抑制HA，证明有NDV存在[1]。

3 禽流感病毒型的鉴定

流感病毒的核蛋白或基质蛋白具有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为A、B、C 3型。禽流感病毒属于A型。一般应用琼脂扩散试验（AGP）、免疫酶技术、免疫荧光抗体技术等来检测A型禽流感病毒。

3.1 琼脂扩散试验

抗原可以采取感染鸡胚的尿囊液或尿囊膜。尿囊液可以通过超速离心或酸沉淀；尿囊膜用研磨器研磨后，冻融3次，1 000 g离心10 min，取上清，经1 mL/L甲醛37 ℃作用48 h后，用作抗原。

琼脂扩散试验一般用0.01 mol/L，pH 7.2 PBS配制9 g/L琼脂，加入80 g/L NaCl。琼脂板按7孔一组的梅花形打孔，中间1个，周围6个。用酒精灯轻烤平皿底部，封闭孔的底部。加样完毕后，静置5 min～10 min，翻面放置湿盒内，于37 ℃温箱培养24 h～48 h，可见沉淀线。被检抗原与阳性血清间出现沉淀线，并且该线和邻近的阳性抗原与血清间的沉淀线相连而不交叉，则该抗原被鉴定为A型禽流感病毒[2]。