鸡传染性贫血病的实验室诊断技术(2)

　　3.3 ELISA试验

　　以部分纯化的细胞培养毒直接包被ELISA板或用单克隆抗体包板捕获细胞培养物中的病毒，可用于检测血清抗体，并且都已用于商品化试剂盒的生产，但由于病毒复制量较低，成本较大，难以大批量生产和推广。Kling（1991）、Otaki（1991）和王笑梅（1998）用病毒感染细胞或裂解上清液作为包被抗原建立了ELISA检测方法，但效果不如纯化或半纯化的病毒。Pallister（1994）以大肠杆菌内表达的重组VPl建立间接ELISA、Kato（1995）以大肠杆菌内表达的LacZ～VP3重组物建立间接ELISA、1wata（1997）以昆虫细胞内表达的VP2和/或VP3表达物包板建立ELISA，都可检测鸡血清中的CAV抗体，并且与其他检测方法（如IFA、VN等）结果的吻合性较好。因此，由于各CAV毒株的基因序列的保守性，以CAV基因的体外表达产物纯化物作ELISA检测原，用于检测鸡血清抗体的ELISA，被证明是既特异又敏感的方法，为CAV血清学诊断开辟了一条新的途径。

　　4 生物技术方法诊断

　　随着分子生物学新方法的不断出现，PCR技术、核酸探针技术以及第二代ELISA技术等已用于CAV特异性检测。对CAV抗原的检测可采用PCR方法，C.Some（1993）报道，利用PCR技术可以从CAV感染鸡体组织内或感染细胞内检测其DNA。Noteborn等采用同位素标记克隆化的CAV基因组作探针进行杂交实验，能够检测出不同毒株感染的细胞中双链复制型及单链环状CAV基因组。Todd等用P32标记的克隆化CAVDNA片段作探针，可检测到CAV感染鸡组织中特异性DNA，随后Noteborn等用非放射性的地高辛（Digoxigenin）标记探针，成功地检测了多株CAV分离株。1995年Nielsen等用生物素标记的双股DNA探针进行原位杂交试验，不仅可以检测到人工感染发病鸡体内的CAV，而且可以检测患蓝翅病病鸡体内所含的CAVDNA。

　　为适应检测敏感性的需要，CAV特异性PCR技术在实验室诊断及疫苗试验上充分体现了该法不可比拟的优势，它不仅与病毒分离法一样敏感，而且能检测到高背景DNA下的CAV分子。Soine等利用套式PCR法（多组引物）扩增出能和特异性探针发生杂交的CAV基因，但此法易造成假阳性结果。CAV感染剂量大小将直接影响其致病程度，故检出敏感细胞或组织中的病毒含量尤为重要。Dren等采用热启动PCR法不仅克服了上述缺陷，而且还成功地检测到一个感染细胞，相当于10TCIDs0的CAV分子。