新型猪瘟疫苗的研究和应用前景(2)

　　由于许多从RNA病毒获得的cDNA具有感染性，所以人们预测RNA病毒缺失株的研究也将逐步开展。由于缺失型弱毒苗是人为地将病毒的毒力基因切除，往往不可能完全自行修复，因而不会发生返祖现象，在遗传特性上比较稳定，是今后弱毒疫苗的研究方向之一。采用缺失的方法可能会制造出免疫原性好，且在安全性上更有保证的弱毒疫苗株，也可以改造现行的免疫原性还不能令人满意的弱毒株以增强其安全性。2.2 CSFV亚单位疫苗　应用化学的方法从病毒粒子中分离出保护性抗原可以制成亚单疫苗。亚单位疫苗是病毒粒子的一部分，不含有核酸，非常安全。亚单位疫苗的免疫原性通常较低，需要与佐剂合用，或偶联到适当的载体上应用。从完整病毒粒子上制备具有免疫原性的亚单位疫苗时，由于抗原量的限制，制备过程复杂，成本往往比较高。因此，采用基因工程的方法，不仅能够克隆得到编码病毒保护性抗原的基因，而且能够在体外对其进行改造或修饰，并重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中，使病毒蛋白获得大量表达。利用真核细胞高效表达系统来表达CSFV免疫原蛋白，并以此表达产物为抗原可获得基因工程亚单位疫苗。
　　Hulist等将猪瘟病毒E2基因cDNA重组入核型多角体病毒（AcNPV），并在sf21细胞中表达。用20-100ug的表达蛋白免疫猪，可抵抗100LD50的猪瘟强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平。目前，该蛋白的表达水平已被提高至60ug/mL，并且该疫苗于1998面被列入欧洲药典。许多研究者对E2基因亚单位疫苗进行了效力试验，证明其对猪有良好的保护作用，但是不能有效防止猪瘟病毒的传播。
　　杆状病毒（Baculovirus）系昆虫病毒，能够在宿主细胞内产生大量的蛋白晶状体——多角体蛋白。这些蛋白覆盖并保护着核体内的病毒粒子。该蛋白的表达受多角蛋白启动子调控。通过痘苗病毒等在细胞内表达的外源性病毒蛋白，经提纯后对动物也具有一定的免疫源性。杆状病毒-昆虫细胞系统可高水平表达外源蛋白，昆虫细胞对蛋白质的加工和运转过程与哺乳动物类似，所表达的蛋白“仿真”程度较高，已成为众多亚单位疫苗研究的工具。亚单位疫苗具有安全、稳定、可规模化生产等优点，同时又可根据流行毒株的变化更换合适的CSFV E2 基因，因而具有广阔的应用前景。2.3 CSFV活载体重组疫苗　某些病毒基因组的某一核苷酸序列，将其切除、突变或在该区域内插入外源性基因片段后，均不影响病毒的复制，是病毒的复制非必需区。利用基因工程的方法可以将该复制非必需区克隆出来，体外改造后再将导源性病毒的保护性抗原基因及启动子调控序列等插入其中，通过体内同源重组技术获得重组病毒，利用该重组病毒接种动物，不仅可以诱导机体产生针对异源性病毒的特异性免疫反应，而且在采用宿主特异性载体病毒时，能够使宿主获得针对载体病毒株的免疫力。如果在载体病毒中同时插入多个异源性病毒的保护性抗原基因还可以达到一针防多病的目的。
　　伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）基因组为一线性DNA分子，约150kb，外源基因可稳定地插入其DNA。将与PRV毒性相关的糖蛋白I（gI）和胸苷激酶（TK）基因灭活，使PRV弱毒化，从而成为发展亚单位重组疫苗的一个较理想载体。将CSFV E2基因克隆到该病毒活载体上，即可获得对伪狂犬病和猪瘟的双重保护。Moormann等于1996年拼接出C-株感染性全长cDNA，用强毒E2基因取代原有E2基因，构建出了猪瘟杂交病毒。这一技术改变了传统意义上的弱毒疫苗研究程式，并且在研究猪瘟病毒的基因功能和感染、复制、免疫机理方面具有重大意义。
　　目前用于表达外源性病毒蛋白的载体包括PRV、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒和小RNA病毒等。以无致病力或低毒力的活病毒为载体，将猪瘟病毒E2基因与之重组研制出的基因重组疫苗免疫动物后，可对2种病毒产生良好的保护力。但是，目前对此类疫苗的安全性和实用价值还有争议，因为人类至今还不了解病毒的自然发生及变异机理，也就无法控制这“人造”病毒的未来走向，一旦将该病毒放入自然界中，重组疫苗载体株与其他弱毒性突变株，有可能改变其生物学特征，衍变出对人、兽有害的病毒变种。另外，利用较为普遍的病毒作为活载体所获得的CSFV活载体重组疫苗对于活载体相应病毒感染或已免疫的动物不能产生保护力。2.4 SCFV DNA 疫苗　DNA疫苗是指注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的病毒保护性抗原基因组表达质粒。以配有原核复制元件和真核表达调控元件的质粒载体，将免疫原基因插入该质粒中，用裸DNA接种动物可产生免疫保护。在保证该重组子在注射动物后不会发生散播，即不具有传染性的同时，该重组子在动物体内对细胞的传染率及在细胞内的表达水平将影响该疫苗的免疫效力。