猪圆环病毒Ⅱ型感染免疫抑制原理研究进展

    圆环病毒感染是新发现的一种传染病。该病对猪的感染率较高，在世界范围内广泛发生，已成为严重影响养猪业发展的传染病之一。圆环病毒主要侵袭猪的免疫系统，干扰和破坏机体对疾病免疫抗体的产生和维持，致使抵抗力下降，从而容易继发或并发其他疾病。近年来，国内外学者对猪圆环病毒入侵免疫系统的机制做了大量研究，在病毒的复制机制、对细胞因子和淋巴细胞的影响以及与猪皮炎和肾病综合征的关系等方面均取得了一定的进展，为猪圆环病毒感染的预防和治疗奠定了基础。 

    目前，多数学者认为猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2， PCV-2)是断奶后仔猪多系统衰弱综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome， PMWS)的主要病因。PMWS在20世纪90年代中期首先发现于加拿大西部，此后相继发现于美国、法国、德国、新西兰、印度、朝鲜、日本和匈牙利等国。2001年底，我国南方一些地区的规模化猪场发生PMWS，2002年疫情暴发，目前已扩散到国内几乎所有的规模化猪场。对欧洲存档血清进行回顾性抗体调查表明，PCV-2感染猪的历史至少已有30多年，PMWS在猪群中也至少存在了15年，但PCV-2的基因组10年来未发现有较大的改变。 

    PCV-2需要一些其他诱因或病原体辅助，才能促进PMWS的发生，使感染猪出现广泛临床症状和病理变化。例如温度因素(低温、高温)、环境因素(氨气、内毒素)、应激因素(猪的混群、长途运输)、免疫刺激(疫苗、佐剂)、病原(猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、副猪嗜血杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌和沙门菌)协同感染等[1]。与PCV-2相关的猪PMWS已在全世界范围内发生和流行，病死率10%～30%不等，较严重的地区，如猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性猪场死淘率高达40%左右。PCV-2还具有免疫抑制特性，可使感染猪不能对其他病原体产生有效的免疫应答，从而易并发其他病原感染(如支原体、细菌、病毒、寄生虫感染等)，使规模化猪场的疾病更加复杂化。由于PCV-2感染的危害和造成的经济损失重大，该病已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继PRRS之后新发现的重要的猪传染病，并成为当今各国学者研究的热点，尤其研究PCV-2的免疫抑制作用将对阐述PMWS的发病机制，防治集约化猪场的疾病以及研制PCV-2疫苗均有重要意义。

    1　PCV-2可以感染单核-巨噬细胞和树突状细胞，但不在其内复制.

    PCV-2是一种嗜单核-巨噬细胞性的病毒。尽管在抗原递呈细胞胞浆中可以检测到PCV-2抗原及其核苷酸，甚至在淋巴细胞中也是如此，但是这些细胞并不是病毒复制的靶细胞。Meehan B M等[2]用流式细胞仪对PCV-2感染的单核细胞和单核-巨噬细胞表面抗原进行了观察，发现这些感染了PCV-2的免疫细胞表面并没有病毒抗原。比较PCV-2感染的淋巴细胞和PK-15细胞，在PK-15细胞中发现了PCV-2子代病毒和病毒复制的中间产物，而在淋巴细胞中却没有发现类似物。由此表明，这些淋巴细胞不是PCV-2首先复制的靶细胞。 

    树突状细胞(dendritic cell，DC)是机体内递呈抗原功能最强的专职抗原递呈细胞(APC)。DC同于其他抗原递呈细胞，其最大特点是能显著刺激初始T细胞(naive T cell)进行增殖，而B细胞及巨噬细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。因此，DC是机体内免疫应答的始动者。研究表明[3]，80%～90%的DC与PCV-2相互作用是发生在感染初期。尽管在DC内没有发现PCV-2的复制，但该病毒却可以在DC中持续存在，且不丧失感染力，也不引起DC的死亡。DC在吞噬PCV-2时，并不诱导MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子、CD80/80L、CD25等表面抗原发生变化。感染PCV-2的DC不会将病毒再次感染同种的T淋巴细胞，即使T细胞已被激活。将T淋巴细胞和感染PCV-2的DC一起培养，不会引起PCV-2的复制、T淋巴细胞和DC的凋亡。 

    PCV-2感染DC的模式使其不但可以逃避宿主免疫作用，而且不使DC凋亡。由于DC能在宿主体内迁移，可作为辅助PCV-2在宿主体内移动的运输工具，因此，PMWS中淋巴细胞的耗竭，并不是由于病毒直接在淋巴细胞中复制导致的，应该还有其他因素的参与。
 
    动物在接种PCV-2后的第125天仍可以在各种组织中分离到病毒或检测到病毒DNA[4]，这种持续存在和不断排毒的能力导致即使宿主康复后，免疫系统仍不能完全清除病毒，因此表面看起来PCV-2对免疫系统无害，但病毒感染与临床症状直接相关。Chang H W等[5]发现革兰氏阴性细菌协同感染对PCV-2复制是一个重要促进因素，至少对PMWS的发展起了一定的作用。PCV-2广泛感染淋巴滤泡DC和其他抗原递呈细胞是PMWS的一个主要特征，但PCV-2对淋巴细胞的耗竭以及对其功能的破坏到底有多大影响还不是很清楚。

    2　PCV-2感染会引起细胞因子的水平发生变化 

    Darwich L等[6]发现，感染PCV-2的猪胸腺和扁桃体中的IL-10和IFN-γ mRNA的量有所增加，而淋巴细胞中IL-2，IL-4，IL-10，IL-12和IFN-γ的mRNA水平有所下降，但其IL-1β和IL-8的mRNA水平却上升。这些变化(尤其是IL-10表达增多)表明PCV-2可以导致T细胞免疫抑制。 

    Siposa W等[7]用半定量RT-PCR和流式细胞仪分别从mRNA水平和蛋白质水平检测了几种细胞因子表达量的变化。其中半定量RT-PCR在血液中检查表明，IL-1α和 IL-10 mRNA在感染猪体内明显上升，而IL-2和IL-2Ra(CD25)的mRNA却下降，IL-8，TNF-α和IFN-γmRNA则轻微上升。用流式细胞仪检测细胞内的细胞因子水平变化发现IL-1β，IL-2和 IL-6上升，IFN-γ轻微下降，而IL-12和 TNF-α表达没有变化。IL-10 mRNA的上升是导致免疫应答不平衡的必要条件。IL-1β和IL-6上升可以导致单核巨噬细胞的激活，IL-8和TNF-αmRNA轻微上升可能与粒细胞浸润细支气管炎的间质性肺炎有关。IL-4表达的下降可能会导致特异性的体液免疫应答下降。IFN-γ mRNA轻微上升而蛋白水平轻微下降不能有效产生保护性的Th1免疫应答。Meerts P等[8]发现IFN-γ可以增强PCV-2在PK-15细胞系和3D4/31细胞系的感染和增值。共聚焦显微镜观察表明，IFN-γ对PCV-2增值是通过增加PCV-2样病毒粒子(VLPs)细胞内摄作用来实现的。 参与免疫调节的细胞因子表达数量的改变使得PCV-2感染后淋巴细胞不能有效地激活和增殖，继而导致巨噬细胞表面抗原MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子表达下降，最终破坏免疫功能。

    3　PCV-2感染可引起淋巴细胞数量变化以及凋亡

    Darwich L等[10]采取PMWS病猪外周血分离到单核细胞，用流式细胞仪检测单抗标记的CD4＋，CD8＋，CD4＋CD8＋和IgM＋的细胞亚群，结果发现CD8＋和CD4＋ CD8＋双阳性细胞亚群明显下降。对PCV-2阳性猪群不同淋巴器官(腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结，Peyer′s淋巴结、扁桃体、脾)的淋巴细胞耗竭程度以及PCV-2病毒载量的研究表明，二者呈正相关，反映出PCV-2对猪免疫系统有明显损害作用。

    Darwich L等[10]采取PMWS病猪外周血分离到单核细胞，用流式细胞仪检测单抗标记的CD4＋，CD8＋，CD4＋CD8＋和IgM＋的细胞亚群，结果发现CD8＋和CD4＋ CD8＋双阳性细胞亚群明显下降。对PCV-2阳性猪群不同淋巴器官(腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结，Peyer′s淋巴结、扁桃体、脾)的淋巴细胞耗竭程度以及PCV-2病毒载量的研究表明，二者呈正相关，反映出PCV-2对猪免疫系统有明显损害作用。

    Nielsen J等[11]给10头3周龄猪接种PCV-2后的第14天到第21天期间，只有4头猪有PMWS症状，但无论猪是否呈现PMWS症状，其淋巴细胞都明显减少。其中CD2＋的B细胞和记忆性Th细胞减少最多，尤其是在感染的初期。T细胞亚群的CD3＋ CD4＋ CD8＋记忆性Th细胞、CD3＋ CD4＋ CD8－初始T细胞、CD3＋ CD4－ CD8＋ T细胞和CD3＋ CD4－ CD8－  gd TCR＋l淋巴细胞都对PCV-2易感，最终导致淋巴细胞减少，同时也导致细胞毒性T细胞(CTLs)和CD3－CD4－CD8＋ NK细胞耗竭，但不影响粒细胞和单核-巨噬细胞。由此可见，PCV-2感染猪后，首先诱导淋巴细胞减少，特别是在感染初期，B细胞和记忆性/激活T细胞最容易受到影响，随着时间的推移，导致B细胞和T细胞同时崩溃，并引发PMWS症状出现。

    CD4＋ T细胞和B细胞尤其是胸腺依赖性B细胞的激活需要APC抗原递呈作用。细胞的增殖是在淋巴细胞被激活和细胞因子产生后才发生。机体对PCV-2的免疫应答在感染初期和出现症状后有所不同。巨噬细胞激活(免疫刺激)是产生PMWS症状的触发因子，而免疫抑制是严重感染的结果。PCV-2感染猪导致的免疫缺陷主要表现在外周血液中的B细胞和T细胞减少。

    在PMWS猪的外周血液中，循环的单核-巨噬细胞增多，而B细胞和T细胞减少。Chianini F等[12]用ISH检测PMWS猪的淋巴组织，发现B细胞减少甚至消失，并伴随有淋巴滤泡的消失。在皮质区和副皮质区，CD3＋ T细胞减少，但单核-巨噬细胞表达的溶解素却增加。CD2＋ T细胞的耗竭与CD4＋ T细胞的减少呈正相关，CD8＋ T细胞数量减少程度较小[13]。Krakowka S等[14]进行PCV-2感染小猪试验时发现，环孢霉素免疫抑制组与非免疫抑制组相比，其组织病变更为严重，且病毒滴度更高，提示免疫抑制是病情恶化的主要因素之一。