野鸭大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的实验室诊断

    鸟禽类大肠杆菌和沙门氏杆菌混合感染是当前禽病流行中的主要趋势，是养禽业的常见病和多发病。2种细菌血清型种类较多，不同地区差别较大；不同菌株之间不产生交叉保护作用，极易产生耐药性。一旦鸟禽发病，治疗时间长、难度大。

    某地野生动物园的一群美国绿头野鸭，在2002年7月中旬突然发病，表现为脚软、不能站立、拉稀、精神不振，死亡率高，曾用青霉素、四环素等药物治疗无效。为了确诊，将病死野鸭进行细菌分离、培养、生化鉴定、药敏试验等。现将结果报告如下。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要仪器。高压灭菌锅，电子天平，生化培养箱，显微镜，恒温箱，无菌操作台。

    1.1.2 被检材料。病死野鸭的心血、肝等组织。

    1.1.3 培养基。普通琼脂、胰蛋白胨、琼脂培养基。

    1.1.4 药敏纸片。青霉素、四环素、万古霉素、杆菌肽、妥布霉素、环丙沙星、诺氟沙星、苯唑青霉素、阿米卡星、头孢噻肟、头胞呋新、卡那霉素、氧氟沙星、壮观霉素共14种药敏纸片。

    1.1.5 微量发酵管。葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、硫化氢、蛋氨酸、乳糖、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素酶、枸椽酸、氨基酸（对照级）共11种微量发酵管。

    1.1.6 姬姆萨氏染液。

    1.1.7 试验动物。8只10～20g昆系小白鼠，由西南农业大学荣昌校区动物科提供。

    1.2 方法

    1.2.1 染色镜检。取病死野鸭心血、肝抹片或涂片，按常规姬姆萨氏染色后镜检。

    1.2.2 分离培养。无菌采集病野鸭心血、肝等，分别接种普通肉汤和胰蛋白胨肉汤，37℃培养24h后观察。若有细菌生长，再划线接种普通琼脂平板，37℃培养24h。

    1.2.3 纯化细菌。将普通琼脂平板上的细菌接种到SS琼脂平板，37℃培养24h，分别挑取单个菌落接种普通肉汤，37℃培养24h，纯化并进行编号，备用（红色菌落编为1号，灰白色菌落编为2号，黑色菌落编为3号）。

    1.2.4 接种动物。将病料组织接种普通肉汤后生长的细菌，接种小白鼠，腹腔注射0.3mL/只，接种后观察发病和死亡情况。

    1.2.5 镜检。挑取SS琼脂上的不同菌落和纯化后的细菌肉汤分别涂片，革兰氏染色，镜检。

    1.2.6 药敏试验。将纯化的1、2、3号菌落按常规方法接种在SS琼脂上，划线，贴上药敏纸片，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，记录结果。

    1.2.7 生化试验。将纯化后的3种菌落，分别按常规方法接种于细菌微量发酵管中，37℃培养24h观察7d，记录结果。

    2 结果

    2.1 病料涂片 姬姆萨氏染色镜检，可见有大量散在的、单个的、纤细的染成淡紫色的细长杆菌存在，3株纯化菌涂片革兰氏染色镜检，可见红色、两端钝圆、散在短小杆菌。

    2.2 病菌分离 培养在普通肉汤和胰蛋白胨肉汤中，可见均有细菌生长、肉汤混浊、试管底部有沉淀。接种SS琼脂平板，可见有红色、灰白色和顶端为黑色的3种菌落，细菌形态为光滑、湿润、隆起。

    2.3 生化试验 培养分离的1号菌，能分解葡萄糖、赖氨酸、卫矛醇、枸椽酸，不产生H2S，不分解鸟氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、尿素、氨基酸；而2、3号菌，能分解葡萄糖、赖氨酸、卫矛醇、鸟氨酸、氨基酸，产生H2S，但不发酵乳糖，也不分解蛋氨酸、苯丙氨酸，其中2号菌能分解尿素酶。

    2.4 动物接种 混合菌接种小白鼠，于十几小时后小白鼠死亡，共死亡7只。剖解见心包积液，小肠出血，心冠状脂肪小点出血，并从死亡小白鼠心血中分离到混合接种菌。

    2.5 药敏试验 通过试验，发现大肠杆菌分离株（1号菌）和沙门氏杆菌分离株（2号强菌），对头孢噻肟、阿米卡星、壮观霉素高敏，对青霉素、四环素等产生耐药性。参照药敏判断标准。

    3 讨论与分析

    病理剖检可见，病鸭心肌出血、肝瘀血肿大、小肠出血；细菌染色镜检可见，两端钝圆的、散在的、短小杆菌；SS琼脂培养基上，有圆形、光滑、湿润、隆起的菌落生长；生化试验结果显示：红色、黑色和灰白色菌落都能分解葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸，且红色菌落能分解乳糖，黑色菌落和灰白色菌落能产生H2S。由此确诊该野鸭为大肠杆菌和沙门氏菌混合感染。

    从生化试验结果可以看出，本次分离的红色菌落能分解葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、乳糖，不产生H2S，不分解尿素酶（与方定一对大肠杆菌生化试验结果基本一致）；但分离的红色菌落不分解鸟氨酸，这可能与不同菌株的大肠杆菌有关。分离的黑色菌落和灰白色菌落能分解葡萄糖、赖氨酸，不发酵乳糖，不分解尿素酶，对苯内氨酸不脱氨（与董国雄报道的沙门氏菌生化试验结果基本一致）；但本次的沙门氏杆菌分离株能水解尿素酶，这可能与沙门氏菌的血清型不同有关。

    药敏试验结果表明：本试验的3株分离菌，对头孢噻肟、头孢呋新、环丙沙星、卡那霉素呈现高敏。除此之外，大肠杆菌分离株还对壮观霉素、丁胺卡那霉素高敏，但对四环素、妥布霉素出现耐药；沙门氏菌分离株，还对壮观霉素、妥布霉素高敏，但对四环素中敏和对青霉素、杆菌肽和万古霉素产生耐药。引起这些结果的原因，可能与大肠杆菌和沙门氏杆菌的血清型不同或长期用药的原因，这在周伦江、龙虎、张健、程安春、张文慧的研究中有类似的报道。

    药敏试验表明，本次分离到的大肠杆菌和沙门氏杆菌，对头孢类药物最敏感，所以给野鸭群投以复方先锋霉素（头孢唑啉）后病情得到了控制。因此，在诊疗中，宜及时进行药敏试验，选择高敏药物治疗，可达到较好效果。