核酸探针法检测对虾疫病

    1、样品采集标准方法

　　1.1　采样器具：眼科剪刀、眼科镊、牙刷、样品容器(1.5毫升塑料离心管、5―10毫升青霉素小瓶、5―10毫升小试管、5―20克小药瓶等小型具塞容器均可)、标签纸、铅笔、样品记录(记录簿或纸张)、烧杯或水杯、滴管、SEMP采样液、l摩尔／升HCl、1％一5％新配制的高锰酸钾或漂白粉。

　　1.2　采样部位

　　1.2.1　亲虾：濒临死亡的亲虾或己冰冻的亲虾，采取少量虾胃，每样品重0.1―2克。

　　1.2.2　各生长期对虾：采集虾胃，对于3厘米以下样品可取虾头。每样品在0.1―2克。

　　1.3　操作步骤

　　1.3.1　清洗干净各种器具、采样容器(用过的容器清洗后，用1摩尔／升HCl浸泡2小时，再充分洗净)。

　　1.3.2　预先在每个采样容器中加入0.5毫升的SEMP采样液。

　　1.3.3　各种与样品直接接触的金属器具在用于处理下一个样品前都必须用牙刷刷洗干净后，在5％新配制的高锰酸钾或漂白粉溶液中浸泡5分钟以上，再用清水洗涤干净后使用，以消除交叉污染。

　　1.3.4　按上述样品采集重量要求用镊子、剪刀采集样品，放入采样容器中，与采样液混匀。一份样品放入一个采样容器。不能互混。

　　1.3.5　用铅笔在标签上写上编号，放入采样容器内或牢固地粘在采样容器上。

　　1.3.6　在样品记录上详细写明①样品编号，②样品种类名称，③个体数量，④采集地点，⑤采集时间，⑥保存方法，⑦现场问题，⑧采样单位，⑨采样人。

　　2、需自备的器材和物品

　　扁头镊子1把，剪刀1把，碾磨棒1个，微型台式离心机1台，吸水纸1合，80℃恒温箱1台，60℃、70℃水浴锅1台，朔料封口机1台，电炉及杯子1只，泡末朔料板1块，不透光盒子1个，计时器或手表1只，移液器或吸管若干，碎冰筷若干，蒸馏水、小烧杯、试管、橡皮塞、量筒若干。

　　3、准备样品

　　取样品或虾的胃置于微型离心管中，加入0.3mg研磨液，用研磨棒将样品充分磨碎。

　　4、检测操作 

　　4.1　泡膜、点样和交联

　　4.1.1　泡膜：用蒸馏水和泡膜液分别泡杂交膜5和10分钟，然后置于吸水纸上晾干。

　　4.1.2　样品变性：将研磨好的样品稍离心，分别取少量上清液置于微型离心管中，编号，注意加上阳性对照样品和阴性对照样品；填写《样品检测结果记录表》中的“样品说明”栏。然后将所有样品插在泡沫塑料板上，于100℃沸水中煮沸10分钟；再迅速置于碎冰块中2分钟以上，直到点样。

　　4.1.3　点样：用点样管吸取变性样品上清，先点样于测试膜的一个方格内，再在参照膜相对应的方格内亦点样，然后置于吸水纸上自然晾干。

　　4.1.4　交联：将点样后晾干的杂交膜夹于两层吸水纸中间，在80℃恒温箱中烘烤2小时。

　　4.2　预杂交和杂交

　　4.2.1　配制预杂交液：将封闭剂完全溶解于预杂交母液中配成预杂交液。

　　4.2.2　预杂交：将两张杂交膜分别置于两个杂交袋中分别加入配制好的预杂交液，用塑料封口机封口，注意赶尽袋中气泡，检查杂交袋是否密封，在70℃水浴中孵育0.5―2小时。

　　4.2.3　探针变性：将探针于100℃水浴煮沸10分钟。立即置于冰水中2分钟以上。

　　4.2.4　杂交：将变性的探针加入测试膜杂交袋中，封口，将两杂交袋在70℃水浴中继续孵育过夜。

　　4.3　加入抗体

　　4.3.1　洗涤：用清洗液I将测试膜和对照膜洗涤2次，每次5分钟。

　　4.3.2　洗涤：用清洗液II将测试膜和对照膜洗涤2次，在60℃水浴中，每次15分钟。

　　4.3.3　洗涤：用缓冲液A将两张杂交膜洗涤2分钟。

　　4.3.4　封闭：将两张杂交膜分别置于两个新的杂交袋中，分别加入封闭液，封口，室温下放置30分钟。

　　4.3.5　加入抗体：将抗体(抗―DIG―AP)加入两杂交袋中，室温振荡30分钟。

　　4.4　显色、观察和记录结果

　　4.4.1　洗涤：用缓冲液A洗涤两张杂交膜2次，每次15分钟。

　　4.4.2　洗涤：用缓冲液B洗涤两张杂交膜1次，2分钟。

　　4.4.3　配制显色液：将显色剂A、B加入到缓冲液B中，混匀。

　　4.4.4　显色：将两张杂交膜分别置于两个新的杂交袋中，分别加入显色液，封口，置于暗盒中(或避光)显色30分钟至2小时。

　　4.4.5　终止显色：显色过程中可随时取出杂交膜观察显色情况、观察后立即放回暗处。当测试膜上阳性对照样品明显出现颜色而杂交膜本底刚有所变色时，立即剪开显色袋，倒去显色液，取出杂交膜，在蒸馏水或自来水中漂洗15―30分钟，终止显色。

　　4.4.6　观察、记录：将杂交膜置于吸水纸上晾干，对光观察结果，记录，详细填写《样品检测结果记录表》。如杂交膜上阴性对照样也现色，则需重做。

　　5、结果判断

　　根据杂交膜的显色情况来判断：以阳性对照样显出的颜色为标准，样品的颜色与阳性对照颜色相同或相近，则样品为病毒携带者；样品的颜色比阳性对照颜色深，则样品为已发病或临死状态；样品不显出颜色，则样品为不带病毒。