国兰茎顶组织培养技术

    中国兰新芽生长期正值南方高温高湿的多雨季节，杂菌繁衍猖獗，土壤、介质中带菌尤为严重。供接种取样的兰盆介质应尽少带杂菌，不施有机肥，放置在透光避雨处，当新芽初露时即让幼芽裸器上面。取6～13cm长的新芽，从植株基部切高，用刮刀除去根、赃物和外包叶2～3片，充分洗净后将材料再切取2～3cm长，在10％次氯酸的药液中消毒10分钟。如带菌严重，应用0．I1%升汞和饱和漂白粉上清波交叉消毒。灭菌后用无菌水冲洗数次，再放到灭菌滤纸上吸干水许，然后在解剖镜下无菌操作利取茎尖和腋芽。如果以去病毒为目的，所剥取的茎尖应在O．2mm以下，否则可剥取2mm以上茎类，带2个叶原基，有利于成活。 

    （一）、原球茎的诱导 

    兰花各个部分的离体组织部能诱导形成原球茎，再经分化培养形成植株。一旦形成原球茎后，就能不断分割继队培养增殖起来，也就是建立了无性繁殖系。兰花的原球茎生命力强，遗传性状稳定，对快速繁殖及种质资源保存极为有利。 

    外植体接种后放置在23一25度的黑暗条件下培养，1～2十月后可分比出1至数个乳白色的原球茎，在解剖镜下观察类似桑果形状的园球突起，以后转绿，再经培养易呈根状茎（或呈树枝状的丛生形），。影响兰花原球茎诱导成功的因素有： 

    1、品种的影响：不同品种由于遗传类型、内源激素和多酚类物质含量等囚素的差异，诱导启动的难度也不尽相同。 

    2、培养基的影响：各品种对不同培养基的适应程度不一样。春兰类品种以White＋BA；＋NAA5＋CM8．5％和B11+BA＋NAA2为好。“夏蕙”、“秋素”等则以MS＋BA0.5＋NAA1十活性炭0.5％的培养基为好。初步观察，春兰品种适应以无机盐浓度和氨态氮含量低，而生长素含量高的培养基。“夏蕙”、“秋素”等品种则适应无机盐浓度较高、生长素含量较低的培养基。 

    3、新芽氏度及材料类别的影响：茎尖无论启动率和成功率均高于测芽以9～13公分的新芽诱导，成功率最高。 

    4、诱导启动后褐变死亡的影响：国兰品种的茎顶接种后成活并膨大呈桑果状原球茎因为启动，成功率尚好，但启动后容易褐变死亡，是国兰组培失败的原因之一。据四川农科院生物技术研究所的资料，褐变死亡数几乎占3／4。由于国兰芽端具有较多的多酚氧化酶，经茎项培养易褐化而死亡，如采用较大的外植体接种，降低培养温度、暗培养、尽量减少伤口面以及在培养基中附加褐变抑制剂（常用抗氧化剂，如芸香苷，柠檬酸等），或配合应用活性炭等，有减轻褐变死亡的效果。 

    （二）、兰科植物多通过原球茎途径分化形成植株。热带兰原球茎多呈园球状，国兰的原球茎则呈丛生状（根状茎）。原球茎形成阶段是兰花大量繁殖的有利阶段，是快速繁殖，提高增殖率的重要环节。茎尖，侧芽接种3～6个月后，根状茎形成时即可分割继代，增殖培养基以W和B11为基本培养基，附加NAA1～2的液体培养基为宜。放置在漫转速转床上加光培养（1～2转／分），每隔15天更换一次培养基，连续继代3～4次后，又转入相同成分，附加有活性炭（0．3％）和柠檬酸（500mg/1）的固体培养基，每月继代一次。液培、固培交替进行。增殖培养中，原球茎的分割不可太小；培养群体不宜太少；培养液则不可过多；继代培养时间不可太长，否则原球茎生长不良，甚至死亡。原球茎可以不断地再分割、增殖，这样就建立了无性系。国兰原球茎的继件次数和时间还有待探索，但从已继代3～5年的原球茎来看，仍保持正常的增殖和分比能力。