免疫鸡卵黄抗体的形成

  　卵黄抗体(IgY)指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。自1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来，卵黄抗体的研究不断深入，目前在卵黄抗体的形成、生物学特性等方面已研究得比较清楚，并且卵黄抗体作为诊断试剂和防治药物的研究愈来愈受到关注。本文就免疫鸡卵黄抗体的研究进展作一综述。

　　1、卵黄抗体的形成

　　禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体；当卵细胞分泌进入输卵管时，流经输卵管的血液中含有的特异性抗体(主要是IgA和IgM)进入卵清中，形成卵清抗体。IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG。与卵黄抗体相比，卵细胞在输卵管中移行的时间较短，因而卵清抗体含量极微。卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用，但同时也会干扰鸡疫苗的免疫效果。

　　2、IgY的性质

　　IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。

　　IgY与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。

　　在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，65℃时可保持24h以上，70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃，30min条件下巴氏消毒不影响IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。

　　IgY在pH4.0-11.0时比较稳定，pH3.0-3.5时活性迅速下降，pH12时活性亦有所下降。

　　IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0时1h后可保持91%的活性，甚至温育10h后仍有63%活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性分别保持39%和41%。

　　3、IgY的作用机理

　　特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。

　　4、IgY分离、提纯方法

　　卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。

　　多年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。

　　1980年，Polson首先提出聚乙二醇(PEG)两步沉淀法，分别用终浓度为3.5%和12%的PEG分步沉淀，用硫酸铵盐析法去除PEG。1985年，在此基础上提出了冷乙醇沉淀的改进方法，使产量提高，而且能有效地去除残留PEG。1981年Jensensius等提出了硫酸葡聚糖沉淀法(DS法)，PEG法和DS法的产量相当，但提取的IgY制品含有一定量的杂蛋白。Bade和Stegemann(1984)用预冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白质并去除脂质，经DEAE柱层析进一步纯化，其IgY抗体活性与用Polson法提纯的IgY之间无明显差别，且稳定性好，经3次以上冻融，抗体活性未见改变。1992年Akita等用水稀释法(WD)提纯IgY，每个卵黄可获得100mg以上的IgY。此后，Akita等比较了WD法、PEG法、DS法和黄原胶法(Xanthan法)的提纯效果，结果表明：WD法产量最高，其次为DS法，WD法更适合大规模生产。

　　1993年，Horikoshi提出了冷乙醇分级离心的方法，分别用60%、30%、25%的冷乙醇沉淀离心，得到纯度达99%以上的IgY。此法适用于大规模制备IgY。

　　工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。

　　5、IgY在动物疾病防治方面的应用

　　5.1 IgY在动物疾病预防方面的应用

　　研究表明，IgY能抵抗幼龄动物肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。故常在幼畜饲料或添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的IgY，以使其获得有效的被动免疫。何月英等利用小鹅瘟强毒制备的卵黄抗体，对2-3日龄雏鹅进行预防，其保护率高达100%。杨晓梅等用鸭病毒性肝炎I型鸡胚毒免疫鸡，制备的鸡抗鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体，经实际应用于预防时，雏鸭的平均成活率为96.9%。

　　5.2 IgY在动物疾病治疗方面的应用

　　目前，卵黄抗体己被广泛应用于许多疾病的防治。汪铭书应用抗鸭病毒性肝炎(DHV)的卵黄抗体治疗人工感染的鸭时，当用1万倍LD50强毒时保护率可达到100%。张英等用抗小鹅瘟的卵黄抗体治疗发病鹅群，治愈率为95.2%。此外，应用多种病原菌免疫制备的卵黄抗体还可以防治多种病原菌的感染。詹丽娥等用IBD、ND和EDS-76三联高免卵黄抗体治疗上述三种疾病，总有效率可达50%以上。日本成功地从鸡蛋中提取出能够杀死幽门螺旋杆菌的抗体，并以这种抗体为原料制成了能杀死人体内幽门螺旋杆菌的酸奶。

　　用卵黄抗体治疗疾病，安全、高效且无公害，我国已有商品化的卵黄抗体供应。

　　5.3 1gY在动物疾病诊断方面的应用

　　卵黄抗体和哺乳动物免疫球蛋白有许多不同之处，如它不与金色葡萄球菌A蛋白结合，不与哺乳动物Fc受体结合，对哺乳动物补体无固定作用等，这使得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度，所以卵黄抗体可以应用于免疫荧光试验、ELISA试验、免疫扩散、免疫电泳等。郑厚旌等用卵黄琼扩实验检验卵黄中的IBD抗体水平，结果表明用卵黄琼扩试验替代血清琼扩试验检测IBD抗体水平是可行的，并且具有经济、省力、省时的特点。此外卵黄抗体有望取代传统的多克隆抗体的生产，获取大量更有效的抗体，同时也可减少对动物的副反应，提高动物的福利。

　　6、IgY开发前景

　　IgY作为替代抗生素的新型饲料添加剂正在引起人们的关注，IgY取代抗生素用作生长促进剂，不会产生药物残留，是一种安全的绿色添加剂。

　　生产技术较为成熟：用鸡卵黄大量生产、制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。

　　IgY产量高，价格低廉。

　　使用IgY技术生产免疫球蛋白，可以减少对动物的应激，提高动物的福利。

　　年龄较大的动物会导致IgY分解失活，然而通过包埋处理可避免这一问题。Shimizu等(1993)用脂质体包埋IgY，在pH2.8的胃蛋白酶中37℃温育1h，包埋的IgY仍可保存80%的活性。

　　综上所述，鸡卵黄免疫球蛋白是一种高产、优质的多克隆抗体，而且鸡大规模工业化饲养成本低，经济方便，同时制备IgY的工艺相对简单。因此，IgY在生物制品的开发和疾病的防治方面具有广阔的前景。应用卵黄抗体防治疾病也有不可避免的缺点，如可能带有蛋传染性疾病的病原，对养禽业存在潜在的威胁。